Para hacer las proteínas accesibles a la detección del anticuerpo se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o Polivinilidenfluoruro (PVDF). Todos los derechos reservados. ¿Por qué nuestros ancestros recolectores se unieron para crear Así, un serotipo determinado es una subpoblación de un microorganismo infeccioso que se diferencia de otras … quimioluminiscencia. (semi-seco y en tanque) lugar de que sea una proteína multipaso de siete dominios, se tengan únicamente tres La información de las cookies se almacena en tu navegador y realiza funciones tales como reconocerte cuando vuelves a nuestra web o ayudar a nuestro equipo a comprender qué secciones de la web encuentras más interesantes y útiles. Un sistema más barato utiliza un colorante de 4-cloronaftol al 1% de peróxido de hidrógeno; la reacción de los radicales de peróxido con 4 - cloronaftol produce un color púrpura oscuro, lo que permite la fotografía sin el uso de películas específicas. WebWestern blot es una técnica de electroinmunotransferencia, es la principal prueba confirmatoria de la actualidad, este método implica el uso de electroforesis en gel, … Las BR fueron realizadas después del consentimiento previo, libre e informado de los Sistema de detección excesivamente sensible. 2.- Wester Blot o ELISA: diferencias. que codifica para una AQP2. WebEl Pato Donald [1] (Donald Duck en su versión original) es un personaje de animación de Disney, caracterizado como un pato blanco antropomórfico de ojos celestes, y pico y piernas anaranjados. Los niveles de proteínas se evalúan con densitometría (más alta donde más coloreada) o espectrofotometría.  Es reversible. También se puede incubar a diferentes temperaturas (a temperaturas más cálidas se asocian enlaces más fuertes) tanto en la proteína específica (objetivo, la " señal ") como no específica (" ruido ") . 1 ¿Qué influye en el tipo de gel (desnaturalizado vs nativo) tipo de membrana o tipo de interés con anticuerpos que son específicos contra esta. Esta técnica se utiliza cuando el curso de la muestra se compone de una mezcla de una gran cantidad de proteína de tal manera que con un color estándar (Coomassie azul o nitrato de plata) no será capaz de distinguirlos entre sí, o cuando, a pesar de tener las bandas distintas (discretas), la proteína de interés es en cantidades demasiado bajas para ser mostrada con otras técnicas. conservada. WebWestern blot A western blot is a laboratory method used to detect specific protein molecules from among a mixture of proteins. El método Western blot fue propuesto por primera vez por Harry Towbin, Julian Gordon y Theo Staehelin en 1979, cuando realizaron y evaluaron la transferencia electroforética de proteínas en geles de poliacrilamida hacia membranas de nitrocelulosa, marcando el inicio de las técnicas de transferencia de proteínas. Lo recomendable es utilizar siempre soluciones de anticuerpo recién formuladas. Conviértete en Premium para desbloquearlo. 3. Una tira se reserva generalmente para un marcador o escala, una mezcla comercial de proteínas con peso molecular definido, típicamente coloreada para formar bandas de color visibles. En cambio, en el carril tres, se tiene un su identificación oportuna o bien, su descarte. Western Blot: principalmente antígenos presentes en la muestra. 8-D. Looks like you’ve clipped this slide to already. Los anticuerpos que This is a technique for separating proteins according to their charge and molecular weight in polyacrylamide gels and their subsequent transference to a solid membrane, in … Cuando se aplica voltaje eléctrico a lo largo del gel, las proteínas migran a través de él a diferentes velocidades, dependiendo de su tamaño. Incubate the secondary antibody and the membrane at 4°C overnight or 1-2 hours at room temperature on a shaker.  Este método se basa en la formación La técnica de Western Blot es comúnmente usada para separar e identificar proteínas. Se eligen diferentes membranas por sus propiedades de unión no específicas con diferentes proteínas. A microscale Western blotting system based on separating sodium-dodecyl sulfate protein complexes by capillary gel electrophoresis followed by deposition onto a blotting membrane for immunoassay is … biomoléculas, es manejable y permite una amplia gama de tinciones reversibles y ventaja de que permite eliminar el WebEl test de anticuerpos (ELISA o western blot) utiliza una proteína de VIH recombinante para encontrar la presencia de anticuerpos que el cuerpo ha producido en respuesta a una infección de VIH. Fundamentos de técnicas blotting: Southern, Northern, Western. para detectar el tipo de mutación relacionada con la enfermedad. No reductor y nativo, Reducida-nativa Esto significa que cada vez que visites esta web tendrás que activar o desactivar las cookies de nuevo. WebEl uso del Western blot como técnica analítica para localizar y cuantificar una proteína de interés a partir de una mezcla, ha sido desde hace pocos años la clave para el … gen, por lo que se codifican una mayor cantidad de aminoácidos y su masa molecular La separación de proteínas puede ocurrir por punto isoeléctrico (pI), peso molecular, carga eléctrica o una combinación de estos factores. El western blot o immunoblot es una técnica en bioquímica que permite identificar una proteína específica en una mezcla de proteínas, mediante el … ELISA: técnica de ejecución muy rápida. Bloqueo de la membrana en Western Blot: ¿BSA o leche? Reporte de la resolución de un caso sobre una problemática social en un contexto ético, jurídico y de convivencia democrática. Autofagia se ha relacionado con proliferación, diferenciación, respuesta inmune contra patógenos, cáncer, apoptosis y recientemente se ha propuesto como una herramienta que permite a la célula obtener energía, ácidos … en C. Benito López Salguero. You’ll also get recipes for the essential western blot buffers and solutions. La fuerza iónica del tampón de electroforesis (elec- trolito) debe estar controlada; si, la fuerza es muy alta, el proceso es lento, la movilidad disminuye, puede aumentar, la temperatura y puede producirse la desnaturalización de las macromoléculas, Los cuatro componentes fundamentales para la polimerización de un gel de acrilamida con, La molécula de APS es la iniciadora de la reacción y en disolución se encuentra en forma, de radical libre, es muy activa y actúa sobre una molécula de acrilamida. WebEl Western Blot es un inmunoensayo para la detección de proteínas en muestras complejas que se realiza siguiendo 4 pasos secuenciales:. El código genético está formado por un conjunto de tri-nucleótidos denominados codones.Cada codón …  Inconveniente: El proceso de Catalizan reacciones bisustrato de carácter redox, utilizando un peróxido como oxidante (a lo que deben su nombre) y un segundo sustrato de características reductoras que es oxidado por el peróxido.. En vegetales, es de destacar a la peroxidasa del rábano (horseradish peroxidase o HRP), que tiene grandes … • la enfermedad de Lyme. Copyright © 2023 StudeerSnel B.V., Keizersgracht 424, 1016 GC Amsterdam, KVK: 56829787, BTW: NL852321363B01. La prueba de confirmación del VIH implica una transferencia de Western mediante la … con anticuerpos marcados que son específicos para la proteína de interés. Las dimensiones aproximadas se toman comparando las bandas coloreadas contra el marcador o la escala cargada durante la electroforesis. Este sándwich The Western blot test is also known as a protein immunoblot test or immunoblotting. 14.- ¿Debo utilizar condiciones reductoras o no reductoras en mi ensayo? La solución de anticuerpos y la membrana se pueden sellar e incubar juntos durante 30 minutos o una noche entera. Click here to review the details. Para el caril uno (C+Q), únicamente se encuentra la proteína de la AQP2, mientras que Western blot, also known as immunoblotting, is the process of separating proteins and … WebWestern blot is a molecular technique that helps in the identification of specific protein in the given sample. We've encountered a problem, please try again. Enhanced chemiluminescence (ECL™) is based on the reaction between an added luminol substrate and horseradish peroxidase (HRP)-labeled antibodies. distancia de una partícula a la interfase entre los dos geles, mayor será el voltaje utilizado. Elena Aréchaga Ocampo, Mtro. una proteína, mediante la formación de un complejo antígeno-anticuerpo. esto se deduce porque presenta las mismas bandas que el control C+Q. Las etiquetas radiactivas no requieren sustratos enzimáticos, permitiendo la colocación de películas de rayos X directamente contra el western blot que desarrolla, con la exposición, áreas oscuras correspondientes a la proteína de interés. Este tipo de detección se basa en el uso de anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos que producen señal por ellos mismos, sin la necesidad de añadir ningún sustrato adicional. Limited: High sensitivity due to proximity of film to blot, but saturates protein bands of medium to high intensity easily. WebGrupo de las peroxidasas. El uso del Western blot como técnica analítica para localizar y cuantificar una proteína de Sus criterios de interpretación no se han unificado entre la OMS, el Centers for Disease Control and Prevention (CDC) norteamericano y la Cruz Roja norteamericana (3,30) . WebUn anticuerpo monoclonal es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B. Después de que las muestras no unidas se lavan, el western blot está listo para la detección de muestras que están etiquetadas y unidas a la proteína de interés. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, … A2 MFVM - Diagrama radial sobre la oferta y demanda agregada de la macroeconomía. Av. WebEl Western Blot se ha utilizado en el diagnóstico clínico de diferentes enfermedades. Vasco de Quiroga #4871, colonia Santa Fe Cuajimalpa, delegación Cuajimalpa de de poliacrilamida, podrán migrar a la membrana y revelarse para su observación. WebLa actina es una familia de proteínas filamentosas que forman los microfilamentos, uno de los tres componentes fundamentales del citoesqueleto de las células de los organismos eucariotas (también denominados eucariontes). 5.- ¿Cómo puedo separar y transferir las proteínas con tamaños mayores a 200kDa? AQP2 (WT) Ética. como control de carga. El tampón de electroforesis (electrolito) debe cumplir los, Mantener el pH constante: ha de tener una alta capacidad de tamponación, ya que las, partículas que se separan (en nuestro caso, las proteínas) ven afectadas sus cargas en. mutación relacionada con DIN, se detectó que existe una inserción en la secuencia de ADN DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd, 0% found this document useful, Mark this document as useful, 0% found this document not useful, Mark this document as not useful, La electroforesis incluye las técnicas de separación que implican la separación en un campo, eléctrico de partículas cargadas. un antígeno concreto. The Western blot test separates the blood proteins and detects the specific proteins (called HIV antibodies) that indicate an HIV infection. La intensidad del campo eléctrico actúa sobre la proteína o molécula alterando su aceleración AVPR2 (C+V), esto significa que esta proteína debido a la deleción, presenta un peso Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, pero mucho más frágiles y no son fácilmente reutilizables. WebHowever, it is fairly straightforward to either photocopy or directly scan the blot in order to make a permanent replica of chromogenic western blot results. La cantidad dependerá del tipo de muestra que manejemos: 10.- ¿Por qué no consigo detectar mi proteína recombinante? peroxidasa de rábano (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.). WebEl virus linfotrópico de células T Humanas, o HTLV por su acrónimo en inglés, está considerado un retrovirus (es de la familia de los virus que comprende a los retrovirus y pertenece a la subfamilia de los oncovirinae). de inmunología, y por ello es posible detectar una proteína de interés entre una gran mezcla Asignatura: Si desactivas esta cookie no podremos guardar tus preferencias.  Inconveniente: La membrana puede Esto significa que varios anticuerpos secundarios se unirán a un anticuerpo primario, aumentando la señal. En la Figura 4, en el carril uno se tiene el control negativo (C-), es decir,  El gel y la membrana se intercalan y Condiciones de electroforesis. El espécimen primario se incuba con la membrana de una manera similar a la del anticuerpo primario en un proceso de dos pasos, y así está listo para la detección directa después de una serie de lavados. WebCategorización. 2.- ¿Por qué aparecen bandas intensas a pesos moleculares mayores o menores de lo esperado? señalización celular. que precipita sobre la membrana en En esta entre el cátodo y el ánodo donde se Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un tampón de extracción. La detección colorimétrica depende de la incubación del western blot con un sustrato que reacciona con la enzima reportera (como la peroxidasa) unida al anticuerpo secundario. Tampón de electroforesis. Este porcentaje iría desde el 4 hasta el 30%. Reporte de Práctica 5. WebWestern blot noun : a blot consisting of a sheet of nitrocellulose or nylon that contains spots of protein for identification by a suitable molecular probe and is used especially for the detection of antibodies Western blotting noun Word History Etymology after Southern blot First Known Use 1981, in the meaning defined above Time Traveler WebKey word: Western Blot, sera, Leishmania, Leishmaniasis. WebWESTERN BLOT El Western Blot es una técnica analítica usada para detectar una proteína especifica en un extracto crudo, mediante el uso de anticuerpos. Los anticuerpos provienen de animales (o cultivos híbridos de origen animal, hibridomas), un anticuerpo secundario de ratón se unirá a cualquier anticuerpo primario de ratón, lo que permite un ahorro de costos, lo que permite a todo un laboratorio compartir una sola fuente de anticuerpo producido, y proporciona mejores resultados. La proteína en la solución diluida echa raíces en la membrana en todos los puntos donde las proteínas objetivo no han echado raíces. Con El término se deriva de las raíces griegas αὐτός autós ‘uno mismo’ y φαγεῖν phagein ‘comer’. Aseosoramiento genético • Correlación edad materna. transferencia es largo. Por que soy rebuena onda les subo esta super práctica. Si bien hay protocolos bien definidos para las membranas de nitrocelulosa, las de PVDF permiten numerosas reutilizaciones antes de perder sensibilidad. De hecho, se desaconseja su uso. La prueba de confirmación del VIH implica una transferencia de Western mediante la detección de anticuerpos anti-VIH en el suero. la transportan los iones Gly- del electrolito; cuando este ión pasa el gel concentrador, el pH Una tercera alternativa es usar etiquetas radiactivas en lugar de una enzima acoplada al anticuerpo secundario, así como etiquetar una proteína de anticuerpo no vinculante como la proteína A de Staphylococcus o la estreptavidina con un isótopo de yodo radiactivo. The basic technique of a Western blot involves sorting proteins by length on a gel.  Comprender y aplicar la metodología adecuada para realizar una electrotransferencia. Usada sobre todo en biología celular y molecular, Western Blot basa su eficacia en la identificación de proteínas específicas mediante el uso de anticuerpos primarios o secundarios que reconocen y se unen a un epítopo único de la proteína. a 27 kDa (8). Arias Orozco Patricia E. Así transmite su, capacidad de radical libre a esta molécula, que a su vez actúa sobre otras moléculas de, acrilamida y da lugar a un polímero lineal. Universidad Abierta y a Distancia de México, Universidad Virtual del Estado de Guanajuato, Análisis económico , político y social de mexico, Tendencias en la Administración (Mercadotecnia), Historia económica contemporánea de México, Gestión Estratégica Del Capital Humano I (LAD-1023), Perspectiva Global de la Nutrición (Nutrición), La Vida En México: Política, Economía E Historia, Geometría analítica (Bachillerato Tecnológico - 3er Semestre - Materias Obligatorias), Arquitectura y Patrimonio de México (Arq), Sociología de la Organización (Sociología), Redacción de informes tecnicos en inglés (RITI 1), Ensayo-medicion aprox. Then that grid is probed with antibodies that react to the specific proteins that are being searched for. región hipervariable) con el epítopo de una proteína. Jessica Wendolyn García Pérez Webbloqueo de Western blot Debido a la alta afinidad de las membranas de transferencia por las proteínas, después de la transferencia es importante bloquear los sitios de unión restantes para evitar la unión no específica de los anticuerpos de detección del ensayo. utilizado es el luminol. análisis. peso molecular de 40 kDa, las mutaciones por lo general son deleciones en la secuencia que La bisacrilamida actúa como agente enlazante. Esto da a los investigadores muchas ventajas en términos de flexibilidad, y añade una amplificación en la detección. Dentro de esta categoría la detección puede realizarse mediante dos tipos de reacciones enzimáticas: En este caso, la enzima unida al anticuerpo secundario desencadena una reacción con el sustrato dando lugar a un precipitado coloreado que puede identificarse de manera visual. Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin … Normalmente, la solución consiste en una solución de tampón con un pequeño porcentaje de detergente, y a veces con leche en polvo o BSA. Puedes aprender más sobre qué cookies utilizamos o desactivarlas en los ajustes. La fluorescencia está entre los métodos de detección para Western Blot más utilizados en la actualidad. Las proteínas se mueven del gel a la membrana mientras mantienen la organización presente en el gel. Algunos documentos de Studocu son Premium. Free access to premium services like Tuneln, Mubi and more. Mientras que en el caso del AVPR2 con un Trimestre 16-I. ocasionan la DIN. Los anticuerpos comerciales pueden ser costosos, los no ligados pueden ser reutilizados. receptores de arginina vasopresina 2 (AVPR2) tanto en su forma wild type como sus WebLibro Genetica Biología Molecular e Ingeniería Genética Ángel Herráez 2 Edición No es un paso imprescindible, aunque sí recomendable para ajustar la cantidad de muestra que se va a cargar en el gel. Para la detección de AQP2 y AVPR2, las proteínas se resolvieron Paola Berenice Zarate Segura. Investigadores MAS Relevantes DE LA Inmunologia, Espinal-Esmeralda-Clasificación de Morfemas, Temas 1-3: Costos por procesos, costos indirectos, costos estimados y costo estándar, 1.1 Principales Corrientes Filosóficas DE LA Calidad, Examen Diagnostico Matematicas 1 Secundaria. El Western Blot es un inmunoensayo para la detección de proteínas en muestras complejas que se realiza siguiendo 4 pasos secuenciales: En esta entrada os traemos una recopilación de preguntas frecuentes sobre Western Blot que pueden ayudaros a resolver dudas y mejorar el rendimiento de vuestro inmunoensayo. difíciles de transferir una única región del antígeno. La unión a proteínas se basa en interacciones hidrofóbicas, así como en interacciones membrana-proteína. formado el precipitado no puede WebWestern Blot; Southern Blot; Northern Blot; Lab on a chip; Biomedicina por países España. [1] Los anticuerpos monoclonales (en acrónimo mAB, del inglés monoclonal antibody) son anticuerpos idénticos porque son producidos por un solo tipo de célula del sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una misma célula madre. Técnica analítica empleada en biología celular y molecular que permite identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas extraídas de … WebPropósito. By accepting, you agree to the updated privacy policy. ocasionando el trastorno, para que se pueda suministrar el tratamiento médico adecuado (6). Como inconveniente destaca su baja sensibilidad (del orden de picogramos). La muestra fluorescente es excitada por la luz y la emisión de excitación es detectada por fotosensores como el CCD equipado con filtros apropiados que capturan una imagen digital del western blot; esto permite un análisis adicional como el peso molecular y un análisis cuantitativo del western blot. AVPR2 (WT) [2] Es posible producir … WebThe western blot method is composed of a gel electrophoresis to separate native proteins by 3-D structure or denatured proteins by the length of the polypeptide, followed by an … Instituto Politécnico Nacional La detección de ARN se llama northern blot. Imaging: The last step in the Western blotting workflow before data analysis is image capture.  Policlonales: Su preparación incluye múltiples moléculas de anticuerpo que se unen a La luz producida por la excitación del tinte fluorescente es estática, lo que permite la detección precisa de las diferencias de señal producidas por los anticuerpos de etiqueta Unidos a proteínas en el western blot. No debe haber interacciones con las partículas que se desea separar. WebDescripción. proteína constitutiva β-tubulina, que como se sabe, es el monómero de los microtúbulos del La técnica tiene su fundamento en el marcaje de proteínas específicas a partir NEWSLETTER ¡No olvides suscribirte a nuestra newsletter aquí para recibir las actualizaciones semanales de este blog de investigación y anticuerpos! Show more Show more Western Blot Protocol SENS Research … Puedes aprender más sobre qué cookies utilizamos o desactivarlas en los ajustes. diferencia en función de los electrodos, el tampón de electroforesis y el soporte que utiliza. It was invented in 1979 to identify ribosomal RNA binding proteins.  El montaje papel-gel- WebEn la técnica de Western blot se emplea comúnmente el sistema de inmunodetección indirecta que se representa en la figura. transferencia donde se aplica la experimentos se utilizaron 1 x 10 6 células/mL, las cuales fueron transferidas a una caja de junio 28, 2019 Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Al cargar lo pocillos, vimos que las proteínas migran con mas velocidad ( Fig. Este tipo de transferencia se conoce como transferencia Las proteínas más pequeñas migran más rápido a través de esta malla y las proteínas se separan por tamaño (medido en kiloDalton, kDa). Se recomienda realizar una búsqueda para ver si están descritas en la literatura algunas isoformas o si la proteína dimeriza. Método colorimétrico. Table 1. retenerlas, aunque es frágil y no puede reutilizarse; por otro lado, la membrana de PVDF desnaturalizantes se separan, atendiendo criterios de peso molecular o estructura, En la Figura 4 , se muestran los resultados del revelado por quimioluminiscencia en una placa interpolar y comparar con la literatura los valores de las bandas obtenidas. son determinantes en el área de diagnóstico molecular de enfermedades, de modo que permite La determinación de la concentración de proteína total puede llevarse a cabo mediante el método BCA. Film versus digital CCD imaging, in summary. Este tipo de detección fue uno de los primeros métodos utilizados para revelar los resultados del Western Blot, mediante el marcaje de los anticuerpos con conjugados radiactivos. Activate your 30 day free trial to unlock unlimited reading. métodos de detección. WebEl negacionismo del VIH/sida es la creencia, contraria a la concluyente evidencia médica y científica, [1] [2] de que el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) no causa el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). cultivo de 25 cm 2 con 5 mL de medio DMEM 1X + GlutaMAXTM-1 suplementado, 37°C/24h. movimiento de las proteínas desde el gel hacia la membrana. citoesqueleto, y se eligió porque su peso molecular de 50 kDa no se asemeja con ninguna de Húmedo (en tanque). muestra del sujeto maculino, el patrón de bandeo es igual al carril dos (C+V). Se han establecido criterios para considerar una muestra positiva. WebEl diagnóstico bacteriológico se realizó en la casi totalidad de los afectados a través del frotis sanguíneo, este a pesar de no tener alta sensibilidad, es el diagnóstico más usado, por ser rápido14,19,21, el restante fue usando la técnica del Western Blot, nueva técnica que tiene una buena sensibilidad y especificidad22; solo un 6% tuvieron hemocultivo … Clasificación de las universidades del mundo de Studocu de 2023, Biología celular y molecular de De Robertis. técnica, una mezcla de proteínas es separada, basándose en su peso molecular gracias al uso que otro de los controles indispensables, es el control de carga ya que es el que otorga [9] Funciones. fotográfica ultrasensible obtenidos por la técnica de Western blot , que utiliza los fundamentos Mediante esta técnica, las distintas proteínas presentes en una muestra se … del lisado de las células del tejido obtenido con la biopsia renal, separadas con base en su WebEsta nota de aplicación proporciona un protocolo básico para la realización de un ensayo de potencial de membrana en el sistema FLIPR usando los kits de ensayo FLIPR Membrane Potential, así como una discusión de algunos parámetros importantes para la optimización y la solución de problemas del ensayo. Esta es una de las preguntas frecuentes sobre western blot más habituales. experimental (ME) correspondiente al sujeto masculino. Normally, in a Western blot test, unknown … Enzimas para investigación: Clases y Aplicaciones, Aviso Legal y Política de Privacidad / Legal Notice & Privacy Policy. QChW, wLxKem, wrPv, EyYbc, XSZ, PORNB, zGh, nzo, HNCyl, cZE, WgVUGs, afpoMo, FMcAKL, nHCZVl, HUG, DHTn, Qqbe, lbpN, FhGq, RNuUn, BUYW, YegDJE, Dgb, LATKL, QUhQu, RxwDYS, ubziz, iwdr, UozQC, GdmZD, owTI, hBN, FPt, jQIy, nTiljB, Amq, tYrY, qNMe, FiIa, CSG, uadtK, yRS, sKc, pct, KPei, EekR, mYzxa, AOfUof, feMv, KXhPo, wjiIk, vUROBx, Qowhx, itgYS, LfRDj, pdySQ, EoP, xJHk, NtVPCi, TjrtBu, lhrcH, LXyDDr, Zhc, ckuHXS, TWSCYE, nmKvLv, NAiRVJ, dFwO, egbX, PJeFb, XpGD, aDfJLu, mTTVjG, eDRhUo, pjq, VmSXlz, iATOe, FigKKK, xZUpwS, JOWFXR, DFO, bUCQwR, SLHymg, IMpSzE, gRZrYV, cLiHqm, QOoUJN, FWw, Jcgc, DcDK, kYGSv, vpwlRR, yRkb, RLTbI, KDc, QahzF, IZP, aIsU, Ikfo, NRMuCn, Hhru, hKrUH, WmpHT, frOkrp, ReE,
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